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文獻解讀

RayBiotech抗體芯片在結腸癌信號通路研究上的應用

時間:2015-05-19 作者:技術部 來源:本站 瀏覽:3009

RayBiotech抗體芯片在結腸癌信號通路研究上的應用

 

雜志名稱The Journal of Clinical Investigation

文獻題目Metastasis-associated PRL-3 induces EGFR activation and addiction in cancer cells

實驗用品AAH-PRTK-1 & AAH-GF-1抗體膜芯片

AAH-PRTK-1 (71個酪氨酸激酶受體磷酸化抗體芯片)

AAH-GF-141個生長因子抗體芯片)

實驗樣品AAH-PRTK-1-細胞裂解液 (1.2mg總蛋白);AAH-GF-1-細胞培養上清(無血清DMEM培養基);

研究背景:蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs與蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine KinasesPTK)共同維持著酪氨酸蛋白磷酸化的平衡,參與細胞的信號轉導,調節細胞的生長、分化、代謝、基因轉錄和免疫應答等。PTP活性的失調導致酪氨酸磷酸化的異常,與各種疾病包括糖尿病,類風濕性關節炎,癌癥等的發生發展有密切關系。PRL-3Phosphatase of Regenerating Liver-3)是近年發現的屬于蛋白酪氨酸磷酸酶PTPsProtein Tyrosine Phosphatases)家族的成員,其在18個大腸癌的肝轉移病人中存在高表達現象,在相應的原發腫瘤和正常上皮細胞中表達水平較低。與轉移相關的蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3在推動癌癥進展中起到多方面的作用,但PRL-3的信號作用機制仍然不完全清楚。

研究思路

1、細胞培養和轉染

細胞系: aA2780:卵巢癌細胞;bHCT116:結直腸癌細胞;cA431 人表皮鱗癌細胞;dMDA-MB-468 人乳腺癌細胞

細胞轉染aEGFP (vec)轉染;bEGFP-PRL-3轉染;cpFLAG(vec)轉染;dpFLAG-PTP1B轉染;

2、細胞刺激實驗

EGF刺激細胞,80%鋪滿的單細胞層用PBS清洗后,換用無血清培養基培養16hEGF 100ng/mL刺激20min后收集細胞裂解。

3RayBiotech抗體芯片檢測

AAH-PRTK-1芯片檢測細胞內酪氨酸受體磷酸化水平。

AAH-GF-1芯片檢測細胞上清中生長因子表達水平的變化。

  芯片結果揭示PRL-3過表達激活A431細胞中的EGFR的活性

 

WB結果表明PRL-3激活EGFR的活性依賴于胞質酪氨酸激酶SRC的活性,細胞上清的芯片檢測結果表明PRL-3激活EGFR的活性可能與自分泌刺激無關

4WB、RT-PCR檢測磷酸化、驗證芯片結果

5、免疫熒光、細胞增殖實驗、基因芯片檢測、克隆形成、腫瘤移植實驗

  

從試驗結果中可以得出,PRL-3通過下調PTP1B誘導EGFR 高度磷酸化

 

圖中清楚揭示PRL-3通過PTP1B快速激活EGFR,從而引起腫瘤細胞加速發展

 

6、統計分析  T檢驗,方差分析,非參數U檢驗、Spearman秩檢驗、K-M生存分析

 

實驗結果本研究表明,PRL-3誘導EGFR過度活化,并在多種人類癌癥細胞系中引起其下游信號級聯反應。 PRL-3誘導活化EGFR主要歸因于轉錄下調蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B, 該磷酸酶對EGFR有抑制作用。從功能上來說,PRL-3誘導EGFR過度激活與細胞生長的加速、遷移以及致瘤性息息相關。此外,PRL-3誘導的細胞傾向于EGFR信號,通過特異性抑制EGFR,致癌屬性會明顯逆轉。臨床顯示,PRL-3的表達升高可作為異質結直腸癌(CRC)病人對EGFR抗體藥西妥昔的治療有好的反應的預測指標。 對PRL-3驅動的EGFR過度活化及隨之而來的EGFR誘導的下游信號的鑒定,開辟了抑制癌癥發展新的途徑。本研究表明, PRL-3 表達升高是一個重要的臨床生物標志物,可以預測哪些病人對anti-EGFR的癌癥療法有效。

 
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